HPLC（高速液体クロマトグラフィー）

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詳細・スペック

＜HPLCの特徴＞

HPLCでは移動相の液体を高速で流し、溶出成分を検出器で検出できるため、常圧でのクロマトグラフィーと比較し、容易で迅速な分離分析を行うことができます。定性分析、定量分析（外部標準法、内部標準法）の両方を行うことが可能です。
試料の種類や目的に合わせ、順相、逆相、ゲル浸透、イオン交換など、種々のカラムクロマトグラフィーを行うことが可能です。
装置は主に、移動相の液体を流すための送液ポンプ、試料注入部分、固定相カラム、検出器で構成されています。送液ポンプは目的の組成の溶媒を自動で調製できるものもあります。また、オートサンプラーを用いることで試料注入を自動で行うことができるため、大量のサンプルの解析も可能です。
医薬品や食品、生体試料など熱に弱い物質の分析に効果を発揮します。

＜HPLCの原理＞

HPLCでは、水または有機溶媒に溶解した試料の固定相―移動相間の分配差により分離が行われます。分配差が生じる理由として、脱吸着作用、イオン対形成、ファンデルワールス力、双極子相互作用、水素結合、誘電相互作用、クーロン力、イオン交換作用等が挙げられます。
固定相の種類により、順相、逆相、ゲル浸透、イオン交換クロマトグラフィーに大別され、ゲルろ過クロマトグラフィーでは分子の大きさを固定相が認識することで分離が行われます。分離成分の検出はUV、蛍光、RIを用いて行われ、検出可能な物質や感度が異なります。
定性分析を行う場合は、同一条件において標準試料の保持時間と未知試料の保持時間を比較することで化合物の同定を行うことができます。カラム、移動相の組成・流量、温度などが同一の条件であれば同一物質は同じ保持時間を持ちます。
定量分析では外部標準法あるいは内部標準法が用いられます。外部標準法では濃度既知の標準物質を用いて濃度/ピーク面積の検量線を作成し、未知試料の濃度を算出します。内部標準法はまず標準試料に内部標準物質を加え、濃度比/ピーク面積比の検量線を作成します。その後、内部標準物質を加えた未知試料の濃度を算出します。

＜HPLCの前処理＞

試料中に夾雑物や分析妨害物質が含まれていると考えられる場合は、適切な前処理を行う必要があります。前処理を行うことで分析感度・精度の向上やカラムの長寿命化が期待できます。
前処理の仕方は試料によって異なりますが、基本的なものとしてはろ過、固相・液相抽出、ホモジナイズ、除タンパク、遠心分離、誘導体化などがあります。試料の濃度が薄い場合は濃縮、濃い場合は希釈を必要に応じて行います。また、カラムの目詰まりを防ぐためにガードカラムを用いることも有効です。

可能な実験例

・不純物や汚染物質の分析

食品中の残留農薬や化学物質が混入していないかを分析することが可能です。

・アミノ酸分析

誘導体化を行うことで、アミノ酸を選択的かつ高感度で分析することができます。

・糖類の分析

単糖・二糖・オリゴ糖・糖アルコールなどの分離分析にHPLC分析が用いられます。

・生体試料の薬物濃度測定

内部標準物質と生体試料を比較することで、生体試料の薬物濃度を測定することができます。

・鏡像異性体の分離

キラルな固定相を有するカラムを用いることで、エナンチオマーの分離分析をすることが可能です。

・分子量分布測定

ゲルろ過クロマトグラフィーをもちいることで、試料の平均分子量や分散度、分子量分布を測定することが可能です。


※組織により上記実験ができない場合がございます。